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生物電鏡冷凍制樣:做了才知道有多難

2015/6/8 11:32:31      點擊:

臺灣中央研究院植物暨微生物學研究所簡萬能博士作了題為“Ultrastructure of plant cells using high pressure freezing and freeze substitution”的報告。


 

  據介紹,由于早年看到所有的教科書都說想要獲得更好的電鏡觀察結果,就要用冷凍制樣技術,簡萬能便開始了這方面的研究,然而不做不知道,一做才知道有多難。冷凍制樣對于動物來說比較簡單,而對于植物來說由于細胞壁的影響卻非常難。20年來,在研究當中,他碰到的失敗的次數永遠比成功多。“但是當你成功后,你會發現你的眼界比以前做化學固定大得多。”簡萬能這樣說道。

  “電鏡是生物學研究非常有用的工具。由于生物細胞的含水量可以達到80%-90%,所以制樣能否成功主要是解決水的問題。傳統的透射電鏡制樣技術,對樣品損傷最大的步驟是脫水,往往使得細胞結構發生很大的變化。而利用冷凍制樣最大的優點就是可以保持細胞原來的結構,并保持一些可溶性的物質。如果要做溶在細胞質里的元素分析,一定要采用冷凍制樣技術。”

  由于水在冷凍的過程中會形成冰晶影響觀察,所以在如何避免形成冰晶是冷凍制樣的一個關鍵點。簡萬能表示:“在制樣中一定要注意一些關鍵的溫度節點。如-137℃是水的重結晶點,如果能迅速降低到這一溫度,樣品中的水就會形成玻璃態的冰。如果超過-70℃,玻璃態的冰就會形成二次冰晶。”

  在報告中,簡萬能介紹了目前常用的冷凍方法,如投入式冷凍、冷金屬塊撞擊式冷凍、丙烷噴射冷凍、高壓冷凍等。并指出高壓冷凍的優點是可以做活的生物樣品,可以做超過200μm厚的樣品。

  此外,簡萬能還介紹了在冷凍固定之后,如何更好的實現冷凍置換。他表示,如果要做超薄切片,高壓冷凍和冷凍置換是最好的選擇,可以獲得非常好的樣品形態,會有更多的信息被保留。

  在研討會之后,簡萬能博士親自指導參加培訓的學員,進行了投入冷凍、高壓冷凍、冷凍置換等實驗操作。

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